吡咯的筛二选和喹啉醌产菌种鉴定生菌
2.2 HPLC法检测PQQ
本实验首先研究了其他色谱柱检测PQQ,吡咯结果发现普通C18柱无法使PQQ有效保留,喹啉醌产更换流动相甲醇和乙腈,生菌或者是选和梯度洗脱都不能保留PQQ。另外发现改变pH可以使PQQ有所保留,菌种鉴定但峰形较差,吡咯且拖尾严重,喹啉醌产并且不能很好分离样品发酵液中的生菌PQQ。考虑到PQQ极性较大,选和因此采用耐100%水的菌种鉴定COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱来使PQQ有很好的保留。将准备好的吡咯7个不同浓度的PQQ标准品(100,50,喹啉醌产25,生菌12.5,选和6.125,菌种鉴定5,2.5 mg/L)进行HPLC检测,每个浓度连续进样3次,每次进样20 μ L。结果如图1所示。不同浓度的PQQ均在3.56 min左右出峰。随着PQQ浓度的增加,峰面积也逐渐增加。因此PQQ浓度与峰面积呈正相关的关系。以PQQ浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,线性关系为y=30.27x+7.32,R2=0.9998,说明线性关系良好。采用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱检测PQQ,运行时间短,PQQ出峰时间早,检测效率高。本实验建立的HPLC法检测PQQ具有良好的可行性,可作为菌种产PQQ的复筛方法。
2.3菌株的筛选和鉴定
经光谱法初筛,从100多个样品中筛选到50多株PQQ产生菌,大多数的产量在2~5 mg/L,少数可以达到10 mg/L左右,HPLC复筛后其中PQQ产量最高的1株为20.6 mg/L,峰图如图2所示,PQQ在3.57 min出峰,这是未经优化已报道的摇瓶较高产量。
该菌株的菌落在甲醇培养基平板上为乳白色,粘稠的,边缘整齐,直径较小,为1~2 mm。菌体细胞为球状,革兰氏阴性,不产芽孢,有荚膜,无鞭毛。该菌株在以甲醇和甲胺为碳源的培养基中能够良好生长,能利用D-葡萄糖,蔗糖,果糖和木糖。在以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏为氮源的培养基中能良好生长。采用PCR技术扩增该菌株的16s rDNA 基因序列,经上海生工测序。通过在 NCBI网站中进行同源性序列搜索及比对,从中选取同源性较高菌株的16s rDNA基因序列,以集团外菌种作对照,通过MEGA软件,用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。结果如图3所示,该菌株与 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的同源性最高,为99%。综合菌落及菌体形态特征、16s rDNA序列分析,鉴定该菌株为Methylopila sp.菌株,命名为Methylopila sp.Z1。
2.4 甲醇含量的优化
研究甲醇的不同添加浓度(0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%)对OD600和PQQ产量的影响,结果如图4所示。在0.5%~2.5%的浓度范围内,随着甲醇体积浓度的提高,菌体OD600和PQQ产量也逐渐提高,当甲醇浓度为2.5%时,OD600和PQQ产量均达到最高,继续增加甲醇浓度,OD600和PQQ产量均有明显下降。这是因为甲醇作为细菌生长的唯一碳源,并且还是细菌细胞甲醇脱氢酶的底物,在其浓度较低时,不足以提供能量使细胞生长,也无法生产过量的PQQ排泄到培养基中,导致PQQ合成效率非常低。当甲醇浓度逐渐提高时,细胞所能利用的碳源增加,菌体OD600和PQQ产量也逐渐增加;当甲醇浓度超过2.5%时,由于甲醇的毒性使细胞损伤,并且底物浓度过高抑制甲醇脱氢酶的活性,导致菌体OD600和PQQ产量下降。因此,2.5%的甲醇体积浓度对于菌体生长和PQQ合成是最佳选择。
3 结论
目前PQQ的检测方法主要有重组酶法,氧化还原法,光谱法和HPLC,其中重组酶法所用到的葡萄糖脱氢酶提取繁琐,纯化过程复杂,且得到的酶活不高,不足以支持大量的菌种筛选;氧化还原法中用到的显色剂氯化硝基四氮唑蓝(NBT)易受培养基中其他成分的干扰,造成阴性结果。光谱法操作简单,检测快速,但也可能受到培养基中具有相似波长吸光度的影响,但本实验采用的是甲醇无机培养基,并通过HPLC检测样品发现,基本没有干扰,因此光谱法作为PQQ产生菌的初筛是高效可行的。本实验还建立了新的HPLC法检测PQQ,采用亲水色谱柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ,使得PQQ有很好的保留,并且样品运行时间短,PQQ在3.56 min出峰,出峰时间早,检测时间短,峰形无拖尾,为PQQ检测提供一种新的改进方法。
由于PQQ的生物合成机理没有得到完全阐释,通过基因工程和代谢改造提高PQQ的产量远低于野生菌的产量,因此从环境中筛选具有高产PQQ能力的菌种是十分必要的。本实验从样品中筛选到一株PQQ高产菌,经鉴定为Methylopila sp.属,命名为Methylopila_sp. Z1,未经优化的摇瓶产量达到20.6 mg/L,属于已报道的较高水平。Z1菌株耐受较高甲醇,在培养基甲醇浓度为2.5%时,PQQ产量达26.7 mg/L,相比于初始浓度提高了28%。Z1是一株有高产PQQ潜力的菌株,后续发酵罐培养和优化工艺将进一步提高PQQ产量。
声明:本文所用图片、文字来源《食品与发酵工业》,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系删除
相关链接:硝酸盐,蛋白胨,葡萄糖
(责任编辑:休闲)
-
泰拉瑞亚的魔法武器体系以其丰富的机制和独特的战斗风格,成为许多玩家探索游戏深度时的核心选择。从初期的简陋法杖到终局的星云套装,魔法职业的成长路径不仅需要玩家对武器特性的精准掌握,更考验其对战斗节奏、魔 ...[详细]
-
模拟江湖猎户怎么招募?模拟江湖猎户冷喻招募攻略在模拟江湖的世界中,猎户作为重要的角色,其招募工作至关重要。而冷喻作为其中一位颇具特色的猎户,他的招募攻略更是值得深入探讨。将从多个方面为大家详细阐述模拟 ...[详细]
-
恶果之地全 BOSS 打法攻略:仙人掌、蜘蛛蟹打法指南在恶果之地的冒险旅程中,BOSS 战无疑是最为刺激和具有挑战性的环节。其中,仙人掌和蜘蛛蟹这两位难缠的对手,更是让许多玩家头疼不已。今天,我们就来 ...[详细]
-
死地安装及配置说明:详细步骤与注意事项在信息技术飞速发展的今天,各种软件和系统的安装与配置成为了我们日常工作和生活中不可或缺的一部分。其中,“死地”作为一款特定的软件或系统,其安装及配置过程需要我们格 ...[详细]
-
中国消费者报杭州讯记者施本允)由于2006版《台州市旧机动车买卖合同》依据的《合同法》已经废止,且旧文本的部分条款难以满足当下二手车交易市场发展新需求。日前,浙江省台州市市场监管局对2006版《台州市 ...[详细]
-
迷你世界混乱结晶怎么获得?获取攻略大揭秘在迷你世界的奇妙世界中,混乱结晶是一种极为珍贵的物品,它拥有着独特的作用和价值。许多玩家都对如何获得混乱结晶充满了好奇,今天我们就来揭开获取混乱结晶的神秘面纱, ...[详细]
-
魔渊之刃飞饼流玩法攻略详解:如何打造强力飞饼流?魔渊之刃作为一款备受玩家喜爱的动作类游戏,其中的飞饼流玩法更是独具特色。飞饼流以其独特的攻击方式和高伤害输出,成为了许多玩家追求的目标。那么,如何打造强 ...[详细]
-
明日之后 5 个小女孩在哪?位置分享及攻略指南在末日废土的世界“明日之后”中,隐藏着 5 个神秘的小女孩,她们的位置成为了众多玩家追寻的目标。这些小女孩不仅有着独特的故事背景,还能为玩家带来丰厚的奖励 ...[详细]
-
门派定位与核心机制作为蜀山手游中极具辨识度的邪道宗门,百蛮一脉以"毒蛊双绝"的诡谲风格独树一帜。该门派完美融合了持续减益与爆发输出的双重特性,通过毒系秘术与蛊虫操控构建起独特的战术体系。在团队作战中, ...[详细]
-
魔兽世界 9.0 纳斯利亚堡 DHT 啸翼打法攻略如何高效通关?
魔兽世界 9.0 纳斯利亚堡 DHT 啸翼打法攻略如何高效通关?在魔兽世界 9.0 的纳斯利亚堡副本中,DHT防战)面对啸翼这个强大的 BOSS 时,需要制定高效的打法攻略才能顺利通关。将从五个方面详 ...[详细]